流式检测巨噬细胞极化，从样本制备到圈门策略全拆解！
肿瘤的发生开展高度依赖肿瘤微环境（TME），其中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是最核心的基质细胞群。巨噬细胞在微环境刺激下可极化为功能相反的两类：M1 型具有抗肿瘤作用，而M2型（即典型TAM）则顺利获得促进血管生成、免疫抑制、肿瘤细胞增殖与转移等发挥促癌作用。明确肿瘤微环境中M1/M2巨噬细胞的极化格局，是指导肿瘤免疫治疗与预后判断的关键。而流式细胞术正是检测巨噬细胞极化、解析 TAM 功能的核心实验手段，也是召开肿瘤免疫机制研究与临床转化的重要基础。
不同巨噬细胞的抗原表达
图片来源：Zhu, Liya, et al. "Tumor-associated macrophages as a potential therapeutic target in thyroid cancers." Cancer Immunology, Immunotherapy 72.12 (2023): 3895-3917.
mmunology, Immunotherapy 72.12 (2023): 3895-3917.
分组标记：按实验分组准备六孔板，标记荷瘤小鼠信息，每孔加 3ml DMEM 高糖培养基，冰上待用。
消化液配制：将 100× 消化液母液（100mg/ml 胶原酶 I + 20mg/ml DNase I），用 5% FBS-DMEM 高糖培养基稀释 100 倍（终浓度 1mg/ml 胶原酶 I + 200μg/ml DNase I），37℃水浴预热。
器械准备：剪刀、镊子经双蒸水清洗、75% 乙醇消毒后烘干备用。
颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，75% 乙醇消毒；在肿瘤右侧 1cm 处剪 2cm 切口，翻折皮肤暴露皮下肿瘤，沿边缘剪开剥离（避开溃烂部位），放入预准备的六孔板中。
吸去六孔板中多余 DMEM，留 0.1ml 防止干燥；冰上用剪刀小幅度高频剪碎肿瘤，至泥浆状（肉眼无清晰组织块）。
每孔加 2ml 预热的 1× 消化液，用 1ml 枪头打散组织碎末；37℃恒温培养箱消化 30min，每 10min 晃动混匀 1 次（严格控时，可按肿瘤大小调整消化液用量）。
消化后冰上终止：每孔加 4ml 5% FBS-DMEM；将悬液经 70μm 细胞滤网过滤，用注射器后部轻轻研磨滤网上残留组织（轻缓操作），用 DMEM 冲洗滤网；所得悬液 4℃、850×g 离心 5min。
肿瘤单细胞悬液的制备流程（Created in BioRender）
流式染色方案：多色panel设计与阻断策略
离心弃上清，用 FACS 缓冲液重悬细胞，计数后调整细胞密度至2×10⁷个 /mL。
取100 μL细胞悬液加入 U 型底 96 孔板，按100:3比例加入抗 Fc 受体抗体（100μL 加 3 μL），4℃孵育 30 min。
用 FACS 缓冲液按抗体配色表配制流式抗体混合液（含 F4/80、MHCII、CD86、CD206 等靶标抗体）。
每孔加入70 μL抗体混合液，避光孵育（常规 4℃ 30 min，可按抗体说明书调整）。
空白对照：不加对应靶标抗体（仅 FACS 缓冲液），用于区分自发荧光与特异性染色。
荧光扣除对照（FMO）：用于精准设定补偿与阴性门。
染色结束后，每孔加 200 μL FACS 缓冲液，4℃、850×g 离心 5 min，弃上清；重复洗涤 1 次，弃上清后加 300 μL FACS 缓冲液重悬细胞，转移至带滤网的流式管中（同步过滤细胞悬液）；用流式细胞仪检测，FlowJo 10.0 软件分析数据。
抗体配色表
基于 FSC-A（前向散射面积）和 SSC-A（侧向散射面积）圈出完整的肿瘤组织总细胞群，排除细胞碎片；
02
基于 FSC-A 和 FSC-H（前向散射高度）圈出单细胞群，去除粘连的双细胞 / 多细胞团；
03
基于 Fixable Viability Stain 780（APC/Cy7 通道）和 SSC-A，圈出活细胞（Live）群，排除死细胞的非特异性染色干扰；
04
在活细胞群的基础上，基于 CD45（BV785 通道）和 SSC-A，圈出 CD45 + 的总免疫细胞群；
05
在 CD45 + 免疫细胞群中，基于 Ly6G（BV711 通道）和 Ly6C（BV605 通道）排除 Ly6G + 中性粒细胞、Ly6C + 单核细胞等其他髓系细胞；再基于 CD11b（PE/Cy7 通道）和 F4/80（BV421 通道），圈出 CD11b+F4/80 + 双阳性的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）群；
06
在 CD11b+F4/80+ TAM 群的基础上，分别基于不同极化标志物设门：基于 MHCII（PerCP/Cy5.5 通道），圈出 MHCII 高表达的M1 型巨噬细胞（占 TAM 的 43.6%）；
07
基于 CD86（FITC 通道），圈出 CD86 高表达的M1 型巨噬细胞（占 TAM 的 20.6%）；
08
基于 CD206（PE 通道），圈出 CD206 高表达的M2 型巨噬细胞（占 TAM 的 30.6%）。
肿瘤巨噬细胞的流式圈门逻辑
数据来源：金静思, 杨超, and 邓刘福. "肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法." Bio-protocol (2019): e1010311-e1010311.
1、剪碎、终止消化步骤均在冰上操作，保护细胞活性；
2、研磨时切勿用力，避免脂肪污染细胞悬液；
3、消化时间严格控制，不可过长，可按需调整消化液用量。
4、严禁使用补偿过大的荧光通道，避免串色干扰
5、2 次离心洗涤彻底去游离抗体，重悬后过滤上机，防堵仪器
参考文献
[1] Zhu, Liya, et al. "Tumor-associated macrophages as a potential therapeutic target in thyroid cancers." Cancer Immunology, Immunotherapy 72.12 (2023): 3895-3917.
[2] 金静思, 杨超, and 邓刘福. "肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法." Bio-protocol (2019): e1010311-e1010311.
